金担子素A（AbA，1 mg/mL）

制品内容

产品简介

       金担子素 A（Aureobasidin A，AbA）乃是从丝状真菌 Aureobasidium pullulans No.R106 中分离所得的环酯肽类抗生素，其抗真菌能力颇为强劲。AbA 的作用机制在于抑制酵母中 AUR1 基因（1, 2）所编码的肌醇磷酰胺（inositol phosphorylceramide，IPC）合成酶的活性，进而干扰鞘脂合成，以此杀灭菌株。AbA 在较低浓度（0.1 - 0.5 μg/mL）时便能对酵母产生毒性。编码 IPC 合成酶的基因，研究较多的是来自酿酒酵母菌的 AUR1 基因以及构巢曲霉的 AURA 基因，二者具有同源性。对编码 AUR1 - C 基因进行突变可使菌株对 AbA 产生抗性，将其作为蛋白质互作研究的报告基因。

       由于 AbA 能够直接杀死敏感的酵母菌株，而非延迟菌株生长，所以 AbA 筛选有助于阳性克隆的生长与识别。相较于用营养报告基因（如 HIS3）进行低严紧度初筛，AbA 筛选极大程度地消除了背景克隆。在实际操作中，用 AbA 进行初筛时会获取更多克隆，之后再运用 4 个报告子（AUR1 - C，HIS3，ADE2 和 MEL1）进行高严紧度的二次筛选以验证阳性克隆。AbA 极为适合作为阳性克隆子筛选用的药物选择性标记，亦是酵母单 / 双杂交研究中理想的报告子，能够简化酵母双杂交文库筛选。MEL1 和 lacZ 分别编码 α - 半乳糖苷酶和 β - 半乳糖苷酶，可作用于相应底物 X - α - Gal 和 X - Gal 使酵母菌斑或酵母蛋白提取物变蓝。其中，α - 半乳糖苷酶是外分泌酶，在酵母表面就能直接检测到；β - 半乳糖苷酶是内分泌酶，需将酵母破碎后方可检测到。以蓝斑显示酵母细胞内两个蛋白相互作用的方法不仅敏感性较高，而且蓝斑的深浅还能够反映两个蛋白相互作用的强弱。

保存

     2-8℃保存，保质期为2年（若冷冻保存，使用前应震荡混匀）。

使用说明：

双杂交筛选应用如下：

1）应用于自激活检测。把诱饵转化产物涂布在含有 AbA 的缺陷型培养基上。其常用浓度为 200 ng/mL。倘若抑制作用过于强烈，工作浓度可降低至 125 - 150 ng/mL；若自激活过强，工作浓度可以增加，但不可超过 1 μg/mL。

2）用于互作筛选。将上述浓度的 AbA 添加到互作筛选培养基中，把共转或者融合产物涂布于含 AbA 的筛选培养基上，能够有效降低假阳性。

注意：在双杂交过程中，鉴于转化或者融合效率的影响，转化产物或者融合产物无需进行稀释，可直接涂板；若是已经筛选出的菌落进行摇菌后再涂布或点板，则需稀释至单菌落浓度后方可使用。

单杂交筛选应用（pAbAi 体系）

单杂原理：将诱饵序列克隆至 pAbAi 载体形成 pBait - AbAi，经由同源重组整合到 Y1HGold 基因组上，当猎物蛋白与诱饵发生相互作用后，会激活重组酵母菌 AbAr 基因的表达，使得酵母菌对金担子素产生抗性，以此来筛选互作蛋白。

自激活抑制：重组酵母菌存在低背景的 AbAr 的本底表达，并且不同的诱饵表达程度各异。通常会采用 100 ng/mL、150 ng/mL、200 ng/mL 的金担子素对约 2000 个细胞（OD600 为 0.002，取 100μL 涂板）进行筛选，通过梯度的金担子素来抑制菌落的生长，筛选出最低的金担子素浓度，作为后续互作筛选的使用浓度。

注意事项

金担子素的有效浓度与酵母菌单位浓度数量呈正相关关系。当菌液浓度和体积过大时，会致使平板上的菌落连接成片，此时金担子素无法发挥其应有的抑制作用。在菌液浓度和体积适宜的前提条件下，倘若金担子素浓度需超过 1μg/mL 才能够有效抑制，那么该诱饵则不适宜用于金担子素筛选的互作实验。在进行自激活检测时，建议将菌液稀释至 OD 值约等于 0.002，然后再进行涂板操作。

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