pET28a-At1g02860 Tagged ORF clone

产品内容

pET28a-At1g02860 Tagged ORF Clone：2 μg

TE buffer：500 μl

产品信息

产品名称：pET28a-At1g02860 Tagged ORF Clone

产品货号：PET28At1g02860

产品类型：拟南芥基因Tagged ORF克隆

标签（Tag）: His

应用：蛋白表达与纯化

基因ID：At1g02860

转录本：AT1G02860.1

别称：NLA; BAH1; At1g02860; F22D16.14

载体：pET-28a(+)

抗性：kanR

ORF 长度：1008 bp

蛋白长度：335

蛋白分子量：38409 Da

片段物种：拟南芥（Arabidopsis thaliana）

NCBI gene ID：839559

Uniprot ID：Q9SRX9

基因摘要

Encodes a ubiquitin E3 ligase with RING and SPX domains that is involved in mediating immune responses and mediates degradation of PHT1s at plasma membranes. Targeted by MIR827. Ubiquitinates PHT1;3, PHT1;2, PHT1;1/AtPT1 and PHT1;4/AtPT2.

重组质粒ORF序列

>pET28a-At1g02860 Tagged ORF Clone

CACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCC

ATGAAGTTTTGTAAGAAGTATGAAGAGTACATGCAAGGACAGAAGGAGAAGAAGAATCTTCCTGGTGTTGGGTTTAAGAAACTCAAGAAGATTCTCAAGAGATGCAGGAGAAATCATGTTCCTTCTAGAATTTCTTTTACTGATGCAATCAACCACAATTGTTCTCGTGAATGCCCAGTTTGTGATGGGACTTTTTTCCCGGAGCTTCTCAAGGAAATGGAAGATGTTGTTGGATGGTTTAACGAGCATGCTCAGAAGCTTCTTGAGCTTCATTTAGCTTCTGGTTTTACAAAGTGTCTTACTTGGCTCAGAGGCAACAGTCGAAAAAAGGACCATCATGGTTTGATCCAAGAGGGTAAAGATTTGGTTAATTACGCTCTCATCAATGCCGTCGCCATTCGAAAAATCCTCAAGAAATATGACAAGATTCATGAGTCTAGGCAAGGACAAGCGTTTAAGACTCAGGTCCAGAAAATGCGAATAGAAATCCTTCAGTCACCGTGGCTCTGCGAGCTTATGGCGTTTCACATCAATCTGAAAGAATCTAAGAAGGAATCTGGAGCTACTATAACTTCTCCTCCTCCTCCTGTTCATGCATTGTTTGATGGTTGCGCTTTGACTTTCGACGATGGGAAGCCTTTACTTTCCTGCGAGCTCTCTGATTCCGTCAAAGTTGACATTGACTTGACTTGTTCAATATGCCTGGACACGGTGTTTGATCCAATATCTCTAACCTGCGGTCACATATATTGCTACATGTGTGCTTGCTCTGCTGCATCAGTAAACGTAGTTGATGGCTTGAAAACCGCAGAAGCAACTGAAAAATGCCCGCTTTGCCGTGAGGATGGGGTTTATAAAGGTGCTGTTCACTTGGATGAGCTCAATATTTTACTTAAGCGAAGCTGCAGAGACTATTGGGAAGAAAGGCGTAAAACAGAGAGAGCAGAAAGGTTACAACAAGCAAAGGAATATTGGGATTACCAATGCCGAAGCTTCACTGGAATATGA

GAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAAC

黑色：载体序列、红色：同源重组序列、绿色：酶切位点、蓝色：ORF序列

蛋白简介

E3 ubiquitin-protein ligase that mediates E2-dependent protein ubiquitination (PubMed:17355433). Plays a role in salicylic acid-mediated negative feedback regulation of salicylic acid (SA) accumulation (PubMed:18753285). May be involved in the overall regulation of SA, benzoic acid and phenylpropanoid biosynthesis (PubMed:18753285). Involved in defense response (PubMed:35839945). May act as negative regulator of resistance to the necrotrophic fungal pathogen Plectosphaerella cucumerina by modulating the accumulation of the phytoalexin camalexin and the salicylic acid- and jasmonate- dependent defense pathways (PubMed:35839945). Controls the adaptability to nitrogen limitation by channeling the phenylpropanoid metabolic flux to the induced anthocyanin synthesis (PubMed:17355433, PubMed:18552353). Involved in the regulation of inorganic phosphate (Pi) homeostasis in a nitrate-dependent fashion (PubMed:21455488). Directs the ubiquitination and subsequent degradation of the plasma membrane-localized inorganic phosphate transporters PHT1-1 and PHT1-4, to maintain phosphate homeostasis (PubMed:24122828). The ubiquitination of PHTs triggers their clathrin-dependent endocytosis and trafficking to the vacuole through the endosomal pathway for degradation (PubMed:24122828). Functions cooperatively with UBC24/PHO2 to regulate the abundance of PHT1-1, PHT1-2 and PHT1-3 in different subcellular compartments (PubMed:24122828). Regulates Pi homeostasis by mediating, cooperatively with UBC24/PHO2, polyubiquitination of PHT1-4 and its targeting for degradation (PubMed:24474629). Directs the polyubiquitination and subsequent degradation of the plasma membrane-localized nitrate transporter NPF2.13/NRT1.7, to help plants to adapt to nitrogen deficiency by regulating the source-to-sink remobilization of nitrate (PubMed:28032637). Regulates leaf senescence during nitrogen deficiency by mediating, cooperatively with UBC24/PHO2, polyubiquitination of NAC92/ORE1 and its targeting for degradation (PubMed:30374089).

蛋白质序列

>E3 ubiquitin-protein ligase NLA (EC 2.3.2.27) (Protein BENZOIC ACID HYPERSENSITIVE 1) (Protein NITROGEN LIMITATION ADAPTATION) (RING-type E3 ubiquitin transferase BAH1)

MKFCKKYEEYMQGQKEKKNLPGVGFKKLKKILKRCRRNHVPSRISFTDAINHNCSRECPVCDGTFFPELLKEMEDVVGWFNEHAQKLLELHLASGFTKCLTWLRGNSRKKDHHGLIQEGKDLVNYALINAVAIRKILKKYDKIHESRQGQAFKTQVQKMRIEILQSPWLCELMAFHINLKESKKESGATITSPPPPVHALFDGCALTFDDGKPLLSCELSDSVKVDIDLTCSICLDTVFDPISLTCGHIYCYMCACSAASVNVVDGLKTAEATEKCPLCREDGVYKGAVHLDELNILLKRSCRDYWEERRKTERAERLQQAKEYWDYQCRSFTGI

关键词

Alternative splicing;Cell membrane;Membrane;Metal-binding;Nucleus;Reference proteome;Transferase;Ubl conjugation pathway;Zinc;Zinc-finger

载体说明

pET-28a(+)是一种常用的大肠杆菌（E.coli）表达载体，广泛用于重组蛋白的高效表达。pET-28a(+) 凭借其高效表达、灵活标签系统和广泛兼容性，成为分子生物学和蛋白研究的经典工具载体。用户需根据实验需求选择是否保留标签或优化诱导条件。pET-28a(+) 的表达系统基于T7 启动子，需搭配表达T7 RNA 聚合酶的宿主菌（如 BL21(DE3)）以实现高水平蛋白表达；载体包含多克隆位点（MCS）（如 NcoI、BamHI、XhoI 等），便于外源基因插入，并带有N-端 His-Tag（6×His）以通过镍柱（Ni-NTA）纯化重组蛋白，同时提供T7 Tag和thrombin 切割位点以便于标签去除或检测，此外还携带卡那霉素抗性基因（Kan^R）用于阳性克隆筛选。pET-28a(+) 载体采用pBR322 来源的复制起点（ori），维持高拷贝数，并包含T7 转录/翻译元件：其T7 启动子严格依赖 T7 RNA 聚合酶驱动外源基因表达，同时受lac 操纵子调控（由lacI 阻遏蛋白抑制），可通过IPTG 诱导解除阻遏以启动蛋白表达，此外还配备核糖体结合位点（RBS）以优化翻译效率。pET-28a(+) 载体广泛应用于重组蛋白表达，能够高效生产可溶性蛋白或包涵体蛋白；其N-端 His-Tag可通过镍柱（Ni-NTA）进行亲和纯化，快速获得高纯度蛋白，适用于蛋白功能研究，包括酶活性分析、抗体生产及结构生物学研究等。pET-28a(+) 载体需选用DE3 溶原菌（如 BL21(DE3)、Rosetta(DE3)）作为宿主菌，以提供 T7 RNA 聚合酶进行蛋白表达，通常采用0.1–1 mM IPTG进行诱导，但需优化诱导浓度和时间以降低包涵体形成风险；此外，载体携带的 His-Tag 虽便于纯化，但可能影响蛋白功能，可通过凝血酶或TEV 蛋白酶切除标签以满足实验需求。

使用说明

1、以5000 × g离心5 min；

2、打开冻存管，加入20 μL无菌水溶解DNA，并在室温下孵育10 min；

3、短暂涡旋冻存管，然后瞬时离心 (小于5000 × g)。

4、质粒溶液在-20℃下可稳定保存一年，请避免反复冻融。

扩增方案

1、收到质粒干粉后请先5000 rpm离心1 min，再加入20 μL无菌水溶解质粒，室温放置1 min；

2、从-80 °C冰箱中取出相应的感受态，置于冰盒上解冻，并做好标记；

3、取2 μL质粒加至100 μL感受态中，冰浴30min;

4、42 °C热激90 s，再冰浴2 min;

5、加入900 μL无抗的LB液体培养基，200 rpm震荡培养45 min;

6、5000 rpm离心5 min，仅留100 μL上清混匀菌体沉淀；

7、混匀后的菌液加至对应抗性的LB平板上，倒入适量玻璃珠，涂匀液体；

8、将平板正向培养1 h，再倒置培养12 h～16 h;

9、挑取单克隆菌落至对应抗性的LB液体培养基中，震荡培养12 h~16 h，根据实验需要提取质粒。

实验流程示例

1、转化：将本产品质粒转入 BL21(DE3) 感受态细胞；

2、诱导：IPTG 诱导表达；

3、纯化：Ni-NTA 柱纯化，SDS-PAGE 或 Western Blot 验证。

注意事项

1、同一个基因的单个转录序列可能由于发生自然变异 (例如核苷酸多态性)而有所不同，每一种都有其自身有效的存在。

2、该克隆被工程化，但表达取决于基因的性质。

3、本产品仅限于科学研究，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。

4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

Tair 网站：https://www.arabidopsis.org/servlets/Search?type=general&search_action=detail&method=1&show_obsolete=F&name=At1g02860&sub_type=gene&SEARCH_EXACT=4&SEARCH_CONTAINS=1
NCBI网站：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=839559

Uniprot 网站：https://www.uniprot.org/uniprotkb/Q9SRX9/entry

相关文献 (NCBI PubMed ID)

PMID: 15644464; 11130712; 27862469; 17355433; 18552353; 18753285; 21455488; 24122828; 24474629; 28032637; 30374089; 35839945

重组质粒图谱