pET28a-AtMg01360 Tagged ORF clone

产品内容

pET28a-AtMg01360 Tagged ORF Clone：2 μg

TE buffer：500 μl

产品信息

产品名称：pET28a-AtMg01360 Tagged ORF Clone

产品货号：PET28AtMg01360

产品类型：拟南芥基因Tagged ORF克隆

标签（Tag）: His

应用：蛋白表达与纯化

基因ID：AtMg01360

转录本：ATMG01360.1

别称：COX1; COXI; AtMg01360

载体：pET-28a(+)

抗性：kanR

ORF 长度：1584 bp

蛋白长度：527

蛋白分子量：57996 Da

片段物种：拟南芥（Arabidopsis thaliana）

NCBI gene ID：

Uniprot ID：P60620

基因摘要

cytochrome c oxidase subunit 1

重组质粒ORF序列

>pET28a-AtMg01360 Tagged ORF Clone

CACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCC

ATGAAAAATCTGGTTCGATGGCTGTTCTCCACAAACCACAAGGATATAGGGACTCTCTATTTCATTTTCGGTGCCATTGCTGGAGTGATGGGCACATGCTTCTCAGTACTGATTCGTATGGAATTAGCACGACCCGGCGATCAAATTCTTGGTGGGAATCATCAACTTTATAATGTTTTAATAACAGCTCATGCTTTTTTAATGATCTTTTTTATGGTTATGCCGGCGATGATAGGTGGATTTGGTAATTGGTTTGTTCCGATTCTGATAGGTGCACCTGACATGGCATTTCCACGATTAAATAATATTTCATTCTGGTTGTTGCCACCAAGTCTCTTGCTCCTATTAAGCTCAGCCTTAGTAGAAGTAGGTAGCGGCACTGGGTGGACGGTCTATCCGCCCTTAAGTGGTATTACCAGTCATTCTGGAGGAGCAGTTGATTTAGCAATTTTTAGTCTTCATCTATCTGGTGTTTCATCCATTTTAGGTTCTATCAATTTTATAACAACTATCTTCAACATGCGTGGACCTGGAATGACTATGCATAGATTACCCCTATTTGTGTGGTCCGTTCTAGTGACAGCATTCCTACTTTTATTATCACTCCCGGTACTGGCAGGGGCAATTACCATGTTATTAACCGATCGAAACTTTAATACAACCTTTTTTGATCCCGCTGGAGGGGGAGACCCAATTTTATACCAGCATCTCTTTTGGTTCTTCGGTCATCCAGAGGTGTATATTCTCATTCTGCCTGGATTCGGTATCATAAGTCATATCGTTTCGACTTTTTCGGGAAAACCGGTCTTCGGGTATCTAGGCATGGTTTATGCCATGATCAGTATTGGTGTCTTAGGATTTCTTGTTTGGGCTCATCATATGTTTACTGTGGGCTTAGACGTAGATACCCGTGCCTACTTCACCGCAGCTACCATGATCATAGCTGTCCCCACTGGAATCAAAATCTTTAGTTGGATCGCTACCATGTGGGGGGGTTCGATACAATACAAAACACCCATGTTATTTGCTGTAGGATTCATCTTTTTGTTCACCATAGGAGGACTCACTGGAATAGTCCTGGCAAATTCAGGGCTAGACATTGCTCTACATGATACTTATTATGTGGTTGCACATTTCCATTATGTACTTTCTATGGGAGCCGTTTTTGCTTTATTTGCAGGATTTTACTATTGGGTGGGTAAAATCTTTGGTCGGACATACCCTGAAACTTTAGGTCAAATCCATTTTTGGATCACTTTTTTCGGGGTTAATTTGACCTTCTTTCCTATGCATTTCTTAGGGCTTTCAGGTATGCCACGTCGTATTCCAGATTATCCGGATGCTTACGCTGGATGGAATGCCCTTTCCAGTTTTGGCTCTTATATATCCGTAGTTGGGATTTGTTGTTTCTTCGTGGTCGTAACAATCACTTTAAGCAGTGGAAATAACAAAAGATGTGCTCCGAGTCCTTGGGCTCTTGAACTGAATTCAACTACACTGGAATGGATGGTACAAAGTCCTCCTGCTTTTCATACTTTTGGAGAACTTCCAGCTATCAAGGAGACGAAAAGCTATGTGAAGTAA

GAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAAC

黑色：载体序列、红色：同源重组序列、绿色：酶切位点、蓝色：ORF序列

蛋白简介

Component of the cytochrome c oxidase, the last enzyme in the mitochondrial electron transport chain which drives oxidative phosphorylation. The respiratory chain contains 3 multisubunit complexes succinate dehydrogenase (complex II, CII), ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase (cytochrome b-c1 complex, complex III, CIII) and cytochrome c oxidase (complex IV, CIV), that cooperate to transfer electrons derived from NADH and succinate to molecular oxygen, creating an electrochemical gradient over the inner membrane that drives transmembrane transport and the ATP synthase. Cytochrome c oxidase is the component of the respiratory chain that catalyzes the reduction of oxygen to water. Electrons originating from reduced cytochrome c in the intermembrane space (IMS) are transferred via the dinuclear copper A center (CU(A)) of subunit 2 and heme A of subunit 1 to the active site in subunit 1, a binuclear center (BNC) formed by heme A3 and copper B (CU(B)). The BNC reduces molecular oxygen to 2 water molecules using 4 electrons from cytochrome c in the IMS and 4 protons from the mitochondrial matrix.

蛋白质序列

>Cytochrome c oxidase subunit 1 (EC 7.1.1.9) (Cytochrome c oxidase polypeptide I)

MKNLVRWLFSTNHKDIGTLYFIFGAIAGVMGTCFSVLIRMELARPGDQILGGNHQLYNVLITAHAFLMIFFMVMPAMIGGFGNWFVPILIGAPDMAFPRLNNISFWLLPPSLLLLLSSALVEVGSGTGWTVYPPLSGITSHSGGAVDLAIFSLHLSGVSSILGSINFITTIFNMRGPGMTMHRLPLFVWSVLVTAFLLLLSLPVLAGAITMLLTDRNFNTTFFDPAGGGDPILYQHLFWFFGHPEVYILILPGFGIISHIVSTFSGKPVFGYLGMVYAMISIGVLGFLVWAHHMFTVGLDVDTRAYFTAATMIIAVPTGIKIFSWIATMWGGSIQYKTPMLFAVGFIFLFTIGGLTGIVLANSGLDIALHDTYYVVAHFHYVLSMGAVFALFAGFYYWVGKIFGRTYPETLGQIHFWITFFGVNLTFFPMHFLGLSGMPRRIPDYPDAYAGWNALSSFGSYISVVGICCFFVVVTITLSSGNNKRCAPSPWALELNSTTLEWMVQSPPAFHTFGELPAIKETKSYVK

关键词

Calcium;Copper;Electron transport;Heme;Iron;Magnesium;Membrane;Metal-binding;Mitochondrion;Mitochondrion inner membrane;Reference proteome;Respiratory chain;Translocase;Transmembrane;Transmembrane helix;Transport

载体说明

pET-28a(+)是一种常用的大肠杆菌（E.coli）表达载体，广泛用于重组蛋白的高效表达。pET-28a(+) 凭借其高效表达、灵活标签系统和广泛兼容性，成为分子生物学和蛋白研究的经典工具载体。用户需根据实验需求选择是否保留标签或优化诱导条件。pET-28a(+) 的表达系统基于T7 启动子，需搭配表达T7 RNA 聚合酶的宿主菌（如 BL21(DE3)）以实现高水平蛋白表达；载体包含多克隆位点（MCS）（如 NcoI、BamHI、XhoI 等），便于外源基因插入，并带有N-端 His-Tag（6×His）以通过镍柱（Ni-NTA）纯化重组蛋白，同时提供T7 Tag和thrombin 切割位点以便于标签去除或检测，此外还携带卡那霉素抗性基因（Kan^R）用于阳性克隆筛选。pET-28a(+) 载体采用pBR322 来源的复制起点（ori），维持高拷贝数，并包含T7 转录/翻译元件：其T7 启动子严格依赖 T7 RNA 聚合酶驱动外源基因表达，同时受lac 操纵子调控（由lacI 阻遏蛋白抑制），可通过IPTG 诱导解除阻遏以启动蛋白表达，此外还配备核糖体结合位点（RBS）以优化翻译效率。pET-28a(+) 载体广泛应用于重组蛋白表达，能够高效生产可溶性蛋白或包涵体蛋白；其N-端 His-Tag可通过镍柱（Ni-NTA）进行亲和纯化，快速获得高纯度蛋白，适用于蛋白功能研究，包括酶活性分析、抗体生产及结构生物学研究等。pET-28a(+) 载体需选用DE3 溶原菌（如 BL21(DE3)、Rosetta(DE3)）作为宿主菌，以提供 T7 RNA 聚合酶进行蛋白表达，通常采用0.1–1 mM IPTG进行诱导，但需优化诱导浓度和时间以降低包涵体形成风险；此外，载体携带的 His-Tag 虽便于纯化，但可能影响蛋白功能，可通过凝血酶或TEV 蛋白酶切除标签以满足实验需求。

使用说明

1、以5000 × g离心5 min；

2、打开冻存管，加入20 μL无菌水溶解DNA，并在室温下孵育10 min；

3、短暂涡旋冻存管，然后瞬时离心 (小于5000 × g)。

4、质粒溶液在-20℃下可稳定保存一年，请避免反复冻融。

扩增方案

1、收到质粒干粉后请先5000 rpm离心1 min，再加入20 μL无菌水溶解质粒，室温放置1 min；

2、从-80 °C冰箱中取出相应的感受态，置于冰盒上解冻，并做好标记；

3、取2 μL质粒加至100 μL感受态中，冰浴30min;

4、42 °C热激90 s，再冰浴2 min;

5、加入900 μL无抗的LB液体培养基，200 rpm震荡培养45 min;

6、5000 rpm离心5 min，仅留100 μL上清混匀菌体沉淀；

7、混匀后的菌液加至对应抗性的LB平板上，倒入适量玻璃珠，涂匀液体；

8、将平板正向培养1 h，再倒置培养12 h～16 h;

9、挑取单克隆菌落至对应抗性的LB液体培养基中，震荡培养12 h~16 h，根据实验需要提取质粒。

实验流程示例

1、转化：将本产品质粒转入 BL21(DE3) 感受态细胞；

2、诱导：IPTG 诱导表达；

3、纯化：Ni-NTA 柱纯化，SDS-PAGE 或 Western Blot 验证。

注意事项

1、同一个基因的单个转录序列可能由于发生自然变异 (例如核苷酸多态性)而有所不同，每一种都有其自身有效的存在。

2、该克隆被工程化，但表达取决于基因的性质。

3、本产品仅限于科学研究，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。

4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

Tair 网站：https://www.arabidopsis.org/servlets/Search?type=general&search_action=detail&method=1&show_obsolete=F&name=AtMg01360&sub_type=gene&SEARCH_EXACT=4&SEARCH_CONTAINS=1
NCBI网站：

Uniprot 网站：https://www.uniprot.org/uniprotkb/P60620/entry

相关文献 (NCBI PubMed ID)

PMID: 8988169

重组质粒图谱