T4 DNA Ligase T4 DNA 连接酶

制品编号与内容

产品简介

本产品适用于催化相邻DNA链的5’-P末端和3’-OH末端，以磷酸二酯键结合的反应。

在反应中需要Mg2+和ATP作辅因子，分子量为62,000，最适反应pH为7.6。

本产品也可以催化粘性末端之间和平滑末端之间的DNA的连接。

贮存溶液

10 mM Tris-HCl(pH7.5)，50 mM KCl，1 mM DTT，0.1 mM EDTA，50% Glycerol

保存： -20 °C

活性单位定义

在20 μL的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind Ⅲ的分解物在 16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量 定义为1个活性单位（unit）。

酶活检测条件

酶活在以下酶活反应检测液中反应：66 mM Tris-HCl (pH 7.6)，6.6 mM MgCl2， 0.066 mM ATP，10 mM DTT，3.3 μM [32PPi]

用途

DNA 片段和载体 DNA 的连接。

DNA 片段和 Linker 或 Adaptor DNA 的连接。

反应条件

20 μL反应体系中含有：线性化载体 DNA，插入片段 DNA，10× T4 DNA Ligase，10× T4 DNA Ligase Buffer，Nuclease-Free Water。

推荐连接反应体系 (Total 20 μL)

将反应后的连接反应液充分混匀并瞬离，16℃温育 20 min，取 1~5 μL 的连接产物用于 50 μL 化学感受态细胞的转化或进行其他转化实验。

注意事项

1. T4 DNA Ligase 在浓度高于 200 mM NaCl 或 KCl 中会被强烈抑制；

2. 添加连接反应液时，应在冰上进行，酶在使用完后应立即放入-20 °C保存；

3. 在转化实验中，连接反应液添加量不超过感受态细胞体积的 10%；

4. 与 T4 DNA Ligase Buffer 结合的 DNA 可能会在琼脂糖凝胶中出现带移或弥散，为了避免此现象，可以在上样前对酶进行热失活，必要时加入适量的 SDS；

5. 聚乙二醇（PEG）能极大地提高平末端连接的连接效率，PEG 4000 的推荐添加量是连接体系的 5%（w/v）；

转化子数目可通过延长反应时间至 1 h 而增加。