Qizyme® Zero TOPO-blunt Quick Cloning Kit
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产品名称Qizyme® Zero TOPO-blunt Quick Cloning Kit
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产品英文名Qizyme® Zero TOPO-blunt Quick Cloning Kit
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产品用途详见说明书
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保质期1年
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储存条件-20℃
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制品编号与内容
制品编码
包装名称
规格
QR1028S
Qizyme Multi One Step Cloning Kit
20 rxns
QR1028L
Qizyme Multi One Step Cloning Kit
100rxns
产品组分
组分
含量
pucTOPO-Blunt vector：20μl
20 μl
10x Enhancer
20 μl
产品简介
Qizyme® Zero TOPO-blunt Quick Cloning Kit利用拓扑异构酶的再连接活性，可瞬时完成两个DNA片段的连接。我们提供在每个3´磷酸基团连接有拓扑异构酶 I 的线性化TOPO载体，这样载体便能够轻易地将 DNA 序列与载体末端连接在一起。本产品包含自杀基因ccdB的载体，当插入片段与载体成功连接时，破坏ccdB正确表达，宿主细胞能够正常生长，否则宿主细胞不能正常生长，从而实现“Zero”背景。
保存条件
-20℃保存，≤0℃运输；使用过程中避免反复冻融。
优势 ·
无自连、零背景，无需繁琐蓝白斑筛选，效率高达90%以上一步，简单，准确，室温(20℃~37℃)连接，反应仅需5~10min。
克隆实验流程
1） 目的片段制备，选择高保真酶进行PCR扩增，且引物5’端不能磷酸化;
2） 载体，目的片段按摩尔比~1:3，室温(20℃~37℃)孵育5-10min;
3）反应产物转化;
4）本载体由puc57 simple 改造而来，菌落PCR及测序引
具体克隆实验操作
组分
使用量
pucTOPO-Blunt vector
1 μl
10x Enhancer
1 μl
Inserts
x μl
Total Volume
10 μl
不同大小插入片段的推荐用量：
插入片段大小（bp）
最佳用量（ng）
100-1000
10-40
1000-2000
40-80
2000-5000
80-150
I: 克隆反应体系
反应物轻轻混匀后，室温 5-10min。反应结束后可直接用于后续转化或者-20°C保存备用。
注：当片段较大时，可适当延长反应时间至30min
II: 转化
1） 把感受态细胞置于冰中解冻；
2） 加入用于转化的反应产物10μl ，冰中放置30min后，42℃ 热激60～90s；
3）继续冰上放置2min；
4） 添加500 μl S.O.C或者LB培养基，37˚C 摇床培养1 h；
5）将转化菌液离心后弃上清，轻轻将 沉淀悬浮后均匀涂布于含有Amp抗性的LB平板上；
6）37˚C 倒置过夜培养。
注意事项
现象
问题点
对策
转化后菌落很少或者没有
DNA浓度太低
使用推荐的DNA用量或上下做梯度优化
目的片段含有污染.
PCR产物切胶纯化
感受态细胞效率太低
使用效价>1×108 cfu/µg 的感受态细胞效果更好
引物磷酸化
使用未磷酸化引物
阳性克隆较少，多为空载体
被含有相同抗性的载体污染
PCR产物中可能含有模板质粒，推荐切胶回收
产物末端不是平端
使用高保真酶
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