qPCR服务

实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)/qRT-PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光标记物，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过扩增曲线对未知模板进行定量分析的方法。一般用于mRNA转录水平的定量研究、不同样本或基因组中DNA拷贝数的测定、基因芯片结果验证、药效分析等。

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材料接收	RNA抽提	cDNA合成	定量实验	数据分析	结果交付

项目类型	检测方法	荧光定量PCR服务价格
荧光定量 PCR服务	SYBR Green染料法 taqman探针法	位点调试费	RNA提取+逆转录	定量pcr三复孔
荧光定量 PCR服务	SYBR Green染料法 taqman探针法	200元/基因	100元/样品	100元/基因/样品

◆ 备注

1、绝对定量，标准曲线另外收取(260元/基因)。

2、探针法，探针需另外收取费用(500元/条，默认FAM、BHQ)。

1. 绝对定量：用已知浓度的标准品绘制标准曲线，而后通过标准曲线对未知浓度的检测样品进行绝对量（起始拷贝数）分析。
2. 相对定量：以内参基因为参照，比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化，通常用来对mRNA表达量进行分析。一般采用2－ΔΔ Ct 法进行计算。每个样本重复三次。

1. mRNA表达量水平检测：相对定量法。
2. MicroRNA表达量水平检测：通过设计特殊茎环结构的反转录引物，结合实时定量PCR可以精确检测微量样品中microRNA表达水平。内参基因一般用U6。
3. 基因拷贝数检测：如检测样品中不同细菌含量、基因工程菌目的基因拷贝数、环境中耐药基因检测等。采用绝对定量法。

扩增曲线

在RT-qPCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的检测并记录其荧光信号，随着反应的进行，监测到的荧光信号可以绘制成一条曲线，即为扩增曲线。荧光扩增曲线一般分为基线期、指数增长期和平台期。
在RT-qPCR扩增早期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化，此时即为基线期。
PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数形式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数形式生成模板，从而进入 “平台期”。在该时期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR的终产物量与起始模板量之间无线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出初始模板量。
只有在荧光信号的指数增长期，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。

荧光阈值

为了便于对所检测样本进行比较，首先需设定一个荧光信号的阈值，荧光阈值是在扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上，一般荧光阈值设置为3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，但实际应用时要结合扩增效率、线性回归系数等参数来综合考虑。通常荧光阈值都是RT-qPCR仪器自动设置，如无特殊情况，无需更改。

循环阈值
循环阈值（Cycle threshold valve，Ct）即RT-qPCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经过的扩增循环次数Ct值与荧光阈值有关。
—般Ct值位于指数增长期的开始阶段，此时样品间细小误差尚未放大且扩增效率也相对恒定，因此该Ct值具有极好的重复性，尽管平台期的DNA拷贝数波动很大，Ct值却是相对固定的。

计算公式

对于一个理想的RT-qPCR反应：X_n=X₀×2ⁿ；对于一个非理想的RT-qPCR反应：X_n=X₀×（l+E%）ⁿ，其中，n为扩增反应的循环次数，X_n为第n次循环后的产物量，X₀为初始模板量，E%为扩增效率；在RT-qPCR中，在扩增产物达到荧光阈值线时：X_ct=X₀×（l+E%）^ct，其中，X₀为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量，在荧光阈值设定以后，X_ct为一个常数；将上述公式两边取对数，并换算可得如下公式：lgX₀=-lg（l+E%）^ct+lgX_ct；即Ct值与lgX₀呈负相关，据此即可计算出样本中所含的初始模板量。

1、须提供新鲜的足量材料（细胞数106个以上，组织100 mg以上），样品-70℃快递至本公司（干冰或液氮运送，以保证样品质量），亦可提供保证质量的DNA或RNA样品（2 μg以上）；
2、提供靶基因信息，包括基因序列或GenBank Accession Number等。
3、提供详细的背景资料，生物物种信息（Human、Mouse、Rat等）、DNA/RNA来源、基因丰度等。

1、从不同样品中提取核酸（DNA或RNA）；
2、对核酸进行浓度及纯度评级；
3、荧光定量PCR检测；
① 引物或探针的设计与合成；
② 相对定量或绝对定量的选择；
③ 探针法或染料法的选择；
④ 荧光定量PCR仪对目的基因的检测；
⑤ 数据统计和分析（RNA浓度及质量检测报告、荧光定量PCR原始数据及优化数据、扩增曲线、溶解曲线、表达柱形图等）；
4、预实验服务：根据客户提供的目的基因序列或NCBI序列号提供客户引物或探针，并筛选出最优化的引物或探针；
5、正式实验服务：根据预实验筛选的引物或探针对所用样品进行荧光定量PCR的检测，并对结果进行统计和分析。

1、原始下机文件，eds格式（包含融解曲线、扩增曲线、原始数据等所有信息）；
2、结果导出文件，Excel表格（包含Ct值）；
3、相对表达量计算文件，Excel表格（包含相对表达量、计算过程）；
4、电子版实验报告，Word文档（包含实验过程，相对表达量统计、情况说明等）。

1、组织速冻时间：组织离体后，胞内核酸便开始降解，尤其是RNA，故采集时，目的组织离体后，需立即速冻，建议5min内完成，越快越好。
2、组织送样量：送样量过少或过多均不利于提取实验，下限为建议量的一半，上限为建议量的3倍。
3、组织保存管的选择：所有组织样品务必使用离心管或螺纹管保存，切勿直接装入密封袋保存（低温冻脆易破裂，导致样品泄露，交叉污染）。
4、组织样品保存方法选择：首选液氮速冻；没有液氮条件的，可直接放入-80℃冰箱冻存。
5、冻融组织：组织冻存后，一旦冻融，RNA降解概率大于80%，几乎不可能提取成功，此类组织不建议送样。送样前确保组织未发生过冻融情况。
6、对于同一个组织样品需要同时提取DNA和RNA的，请务必分成两管分批次送样。

实验问题	原因	推荐解决方法
Ct 值起跳过晚	引物设计不佳	重新设计引物，RT—PCR摸索好扩增条件。
	扩增效率低	降低退火温度，适当提高镁离子浓度；PCR产物长度控制在100bp左右；荧光染料未降解。
	模版量低	增加反应循环数，提高模版量。
无Ct 值起跳	引物设计不佳	重新设计引物，RT—PCR摸索好扩增条件。
无Ct 值起跳	模板量低	增加反应循环数，提高模板量。
熔解曲线出现双峰？	非特异性扩增条带	优化PCR反应条件，如提高退火温度，降低镁离子浓度；若优化失败需重新设计引物。
	引物二聚体	降低引物浓度或重新设计引物。
	基因组污染	抽提获得的RNA用DNase I消化基因组DNA后进行后续实验。